产品货号：
YTB4026
中文名称：
T4 RNA连接酶I
英文名称：
T4 RNA Ligase I
产品规格：
1KU|5KU
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种ATP依赖的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。T4 RNA连接酶I对于RNA之间的连接效率最高，DNA与RNA之间的连接效率次之，而DNA之间的连接效率最低，因此也被认为是一种ssRNA ligase。
T4 RNA连接酶I催化连接反应过程如下。首先，T4 RNA连接酶I与ATP发生反应，产生中间产物T4 RNA连接酶I-AMP，并释放焦磷酸；接着，AMP从中间产物T4 RNA连接酶I-AMP中转移至核酸的5’磷酸末端，形成腺苷酰化核酸中间产物；最后，在T4 RNA连接酶I的催化下，另一核酸的3’羟基进攻腺苷酰化核酸中间产物的5’磷酸末端，形成3’-5’磷酸二酯键，并释放出AMP。
大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因的来源为T4嗜菌体，该酶分子量约为44kDa。
One unit is defined as the amount of enzyme required to convert 1 nanomole of 5′-[32P]rA16 into a phosphatase-resistant form in 30minutes at 37℃。
保存：-20℃，有效期一年。
10mM Tris (pH7.5),200mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,50%(v/v) Glycerol。
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl(pH8.0@25℃)，100mM MgCl2，20mM DTT。
不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。
65℃加热15min或煮沸2min可使T4 RNA连接酶I失活。或加入10%体积的0.5M EDTA pH8.0也可以终止反应。
相关搜索：T4 RNA连接酶I，ssRNA Ligase，单链RNA连接酶，单链DNA连接酶，单链DNA/RNA环化连接酶，T4 RNA Ligase 1，T4 RNA连接酶1，T4 RNA Ligase I
T4 RNA连接酶I催化连接反应过程如下。首先，T4 RNA连接酶I与ATP发生反应，产生中间产物T4 RNA连接酶I-AMP，并释放焦磷酸；接着，AMP从中间产物T4 RNA连接酶I-AMP中转移至核酸的5’磷酸末端，形成腺苷酰化核酸中间产物；最后，在T4 RNA连接酶I的催化下，另一核酸的3’羟基进攻腺苷酰化核酸中间产物的5’磷酸末端，形成3’-5’磷酸二酯键，并释放出AMP。
- T4 RNA连接酶I主要用于RNA和RNA之间的连接，连接时需要5'磷酸基团和3'羟基的存在。不仅可以进行RNA分子间的连接，也可以进行RNA分子(最短8个碱基)的环化连接。
- T4 RNA连接酶I也可以用于RNA和单核苷酸之间的连接，单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式，此时常用于RNA的3'末端标记。
- T4 RNA连接酶I也可以用于DNA和RNA之间的连接。当DNA提供5'磷酸基团，RNA提供3'羟基时，连接效率较高；当DNA提供3'羟基，RNA提供5'磷酸基团时，连接效率非常低。
- T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之间的连接，但连接效率非常低。主要用于DNA的环化连接，例如5' RACE中的cDNA环化。DNA和DNA之间的连接尽管可以进行，但比较困难。
- ssRNA的分子间连接和环化；
- ssRNA与ssDNA的分子间连接和环化；
- 也可以用于ssDNA分之间连接和环化，但效率较低；
- ssRNA 3′-OH末端用放射性同位素5’-[32P]pCp等的标记；
- 单链Oligo RNA及Oligo DNA的合成；
- tRNA的特别修饰；
- 在5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)实验中，用于寡核苷酸连接到单链cDNA中；
- 在蛋白质中引入非天然氨基酸等。
大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因的来源为T4嗜菌体，该酶分子量约为44kDa。
One unit is defined as the amount of enzyme required to convert 1 nanomole of 5′-[32P]rA16 into a phosphatase-resistant form in 30minutes at 37℃。
| 组分 | 1KU | 5KU |
| T4 RNA连接酶I(10U/μL) | 100μL | 500μL |
| 10×Reaction Buffer | 300μL | 1.5mL |
| ATP(10mM) | 200μL | 1mL |
| RNase-free PEG8000(50%) | 500μL | 1.5mL×2 |
保存：-20℃，有效期一年。
10mM Tris (pH7.5),200mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,50%(v/v) Glycerol。
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl(pH8.0@25℃)，100mM MgCl2，20mM DTT。
不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。
65℃加热15min或煮沸2min可使T4 RNA连接酶I失活。或加入10%体积的0.5M EDTA pH8.0也可以终止反应。
- 本产品连接的底物无论是单链RNA还是单链DNA，都需要确保5’末端磷酸化或腺苷酰化，同时3’末端是羟基。
- 如果连接底物为双链RNA或DNA，推荐使用百奥莱博的T4 RNA Ligase II（YTB4027）等系列产品。
- 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase inhibitor(货号：YT530)、DEPC水(货号：YT528)等。
- 根据连接反应的类型，推荐在反应体系中加入适量的PEG8000(货号：YTB0616)。建议RNA环化反应体系中PEG8000的终浓度为10%，连接单链RNA或DNA的分之间连接反应体系中PEG8000的终浓度为15%～25%，这样可以显著提高酶活性，同时不影响反应特性。
- 对于单链RNA的环化连接反应，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
成分 用量 终浓度 DEPC-treated Water 15.5μL - ssRNA(20μM) 0.5μL 0.5μM 10×Reaction Buffer 2μL 1× ATP(1mM) 1μL 50μM T4 RNA Ligase 1(10U/μL) 1μL 0.5U/μL 总体 20μL -
注意：- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor，尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
- 上述表格中ssRNA的用量已经比较大，对于样品比较少的情况下，完全可以大幅减少ssRNA的用量的。
- 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
- 本产品提供的ATP的浓度为10mM，而用于环化连接反应的ATP浓度为1mM，建议根据具体实验条件进行适当的稀释。
- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor，尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
- 对于单链RNA或DNA的分子间连接反应，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
成分 用量 终浓度 DEPC-treated Water 7.5μL - ssRNA(20μM) 0.5μL 0.5μM 10×Reaction Buffer 2μL 1× ATP(10mM) 1μL 0.5mM PEG8000(50%) 8μL 0.2 T4 RNA Ligase 1 (10U/μL) 1μL 0.5U/μL 总体积 20μL -
注意：- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor，尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
- 上述表格中ssRNA的用量已经比较大，对于样品比较少的情况下，完全可以大幅减少ssRNA的用量的。
- 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
- PEG8000的终浓度可以在15%～25%范围内根据连接效果适当调节。
- 用于分子之间的连接，通常提供5’磷酸的核酸3’羟基需要被封闭(例如氨基修饰)，提供3’羟基的核酸5’端需要被封闭(例如5’端为羟基)。如果提供3’羟基的核酸的量有所不足，提供5’磷酸的核酸的用量可以是提供3’羟基的核酸的2倍左右。
- 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor，尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
- 连接反应：37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h或16℃孵育16h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
- 终止反应：65℃孵育15min或煮沸2min，即可终止反应。
相关搜索：T4 RNA连接酶I，ssRNA Ligase，单链RNA连接酶，单链DNA连接酶，单链DNA/RNA环化连接酶，T4 RNA Ligase 1，T4 RNA连接酶1，T4 RNA Ligase I